乌梢蛇公母蛇从性格上来说，公蛇要更凶、更敏捷点。另外，看尾部比较容易看出来，母蛇从肛门开始到尾巴尖部位比公蛇短，且从肛门开始就明显的变细，如锥形。公蛇尾部明显的比母蛇粗、长，这是因为公蛇的尾部需要藏着一对交配器，看上去明显的比母蛇的尾巴粗长。
如果从外观上还是不能准确的知道是公母，最佳的方法就是挤压检查法。也就是用拇指轻压蛇尾腹部，往上推压，这样公司藏在尾巴里的一对交配器就会挤压出来，如一对肉刺状，而母蛇则没有，只是平滑的肉囊鼓出，比较容易区分。还有就是用探针插入泄殖腔，方法是用专用的鉴定公母蛇的探针，从蛇的泄殖腔向尾部插入，母蛇插入的比较浅，而公蛇则插入的比较深，这种检查公母蛇的方法比较快。